Все публикации

Аннотация:
В связи с развитием пандемии и необходимостью массовой вакцинации разработка вакцин нового поколения против коронавирусной инфекции COVID-19 является важнейшей задачей медицины и биотехнологии. Ввиду распространенности COVID-19, все еще актуально создание безопасной и протективной вакцины, особенно стимулирующей Т-клеточный иммунный ответ. В работе представлены разработка и получение ДНК-иммуногена на основе плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок, содержащий иммуногенные фрагменты структурных белков β-коронавируса SARS-СоV-2. В результате методами генной инженерии была создана векторная конструкция на основе плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок, содержащий наиболее иммуногенные участки структурных белков M, S, N, E β-коронавируса SARS-СоV-2, для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих; методом электропорации был создан штамм E.coli – продуцент ДНК-иммуногена; разработан метод очистки рекомбинантной плазмидной ДНК на основе последовательного постадийного процесса: данная методика позволила получить 100 мг ДНК-иммуногена рСМV-3Таg-3а-СVVV3 в растворе с концентрацией 1 мг/мл (100 мл), соответствующих установленным в Государственной Фармакопее РФ (ОФС.1.7.1.0013.18 ДНК-вакцины) параметрам качества – полученный результат стабильно воспроизводится в лабораторных условиях; были отработаны методики контроля качества плазмидной ДНК и проверена экспрессия гибридного белка методом Вестерн-блоттинга.

Было показано, что антиген СVVV3 специфически связывается с иммуноглобулинами IgG из кроличьих сывороток после иммунизации ДНК-иммуногеном рСМV-3Таg-3А-СVVV3. Доля суперспирализованной плазмидной ДНК в образце ДНК-иммуногена рСМV-3Таg-3а-СVVV3 составила 85,64%, содержание эндотоксинов – менее 25 ЕЭ/мг; концентрация остаточных белков штамма-продуцента в растворе 1 мг/мл ДНК-иммуногена рСМV-3Таg-3А-СVVV3 составила менее 100нг на 1 мл (мг суммарной рекомбинантной ДНК).

Ключевые слова:
SARS-СоV 2, ДНК-иммуноген, гибридный белок, экспрессия.

Аннотация:
The evaluation of cellular immunity to SARS-CoV-2 is a critical tool for assessing vaccination efficacy and development of post-infectious immunity. According to available studies, virus-specific T cells persist longer than antigen-specific antibodies and play a pivotal role in the effective virus elimination from human body. Current methodologies for assessing virus-specific T cells are mostly based on flow cytometry, which require specialized laboratory equipment and highly trained personnel. An alternative approach involves a skin test conducted to assess delayed-type hypersensitivity (DTH) reactions. For this, there has been developed the “CoronaDerm-PS” substance, a sterile isotonic solution for intradermal administration, containing a recombinant hybrid protein that incorporates regions of SARS-CoV-2 structural proteins S, M, N, and E, produced by a genetically modified E. coli BL21 strain cell culture. Following preclinical studies that demonstrated the safety of the above-noted medication, Phase I and Phase II clinical trials were initiated to evaluate safety and specific activity of “CoronaDerm-PS” in apparently healthy volunteers with SARS-CoV-2 post-vaccination and post-infection immunity. In Phase I clinical trial with COVID-19 unexposed or vaccinated volunteers, the data were obtained demonstrating the safety and good tolerability of the medication, thus enabling the progression to Phase II.

The Phase II results provided additional evidence on the preparation’s safety in individuals with SARS-CoV-2 post-vaccination and post-infection immunity, as assessed by clinical and laboratory data. No serious adverse events were observed during the study, and in 93.5% cases, adverse events required no therapeutic or diagnostic intervention. To assess the specific activity of the preparation, the skin test data were compared with the IFNγ production stimulation index for CD4+ T lymphocytes assessed by flow cytometry. The ROC analysis revealed sensitivity magnitude ranging from 76.6% to 84%, and specificity level ranging from 80% to 87.5%. Based on ROC analysis results, “CoronaDerm-PS” can be an informative diagnostic tool (AUC = 0.795), demonstrating high sensitivity (79.8%) and specificity (80.8%), with consistent results across different volunteer cohorts. Analyzing the collected data suggests that “CoronaDerm-PS” is a robust alternative to laboratory methods for evaluating SARS-CoV-2-specific T-cell immunity, with high sensitivity and specificity, suitable for large-scale screening.

Ключевые слова:
SARS-CoV-2, COVID-19, coronavirus antigen Cord_PS, CD4+ T cells, CD8+ T cells, IFNγ, T cell immune response, “CoronaDerm-PS”

Аннотация:
Диагностика специфического Т-клеточного иммунитета к антигенным детерминантам SARS-CoV-2 у пациентов представляется все более важной задачей ввиду накопления данных о роли Т-клеточного иммунного ответа в протекании коронавирусной инфекции и клиренсе SARS-CoV-2 в случае вторичной инфекции. Ранее нами был разработан рекомбинантный антиген CorD_PS для оценки Т-клеточного противовирусного иммунитета, содержащий консервативные и иммуногенные последовательности структурных белков коронавируса SARS-CoV-2. Был получен его штаммпродуцент E. coli CorD_PS со стабильной экспрессией рекомбинантного антигена CorD_PS. Целью настоящей работы является разработка лабораторной технологии получения рекомбинантного антигена CorD_PS, проведение контроля качества полученного химерного белка и изучение его иммунологической активности. Отработку условий культивирования клеток E. coli  CorD_PS проводили в конических колбах в среде LB-M_Km при 37 °C, затем масштабировали в ферментере объемом 30 л. Экспрессию индуцировали добавлением ИПТГ. Контроль экспрессии осуществляли в лизатах культур в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующим центрифугированием. Были подобраны составы лизирующего и солюбилизирующего буферов, а также условия рефолдинга рекомбинантного белка.

Для очистки растворенного белка использовали последовательно катионобменную (SP-сефароза), гидрофобную (Butyl-сефароза) и эксклюзионную (Sephacryl S-200 HR) хроматографии. Белковые примеси в препарате определяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ и электрофореза в 12% ПААГ, остаточные липополисахариды определяли с помощью гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, остаточные белки штамма-продуцента – методом иммуноферментного анализа, остаточную ДНК штамма-продуцента – методом связывания с красителем PicoGreen. Контроль специфичности осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа. Оценку продукции цитокинов CD4⁺Т-лимфоцитами в ответ на их стимуляцию рекомбинантным антигеном ex vivo проводили на проточном цитофлуориметре. Выход биомассы при культивировании E. coli CorD_PS в 30 л ферментере составил до 20 г/л за 4 часа индукции 0,1 мМ ИПТГ. Последовательная отмывка телец включения от бактериальных клеточных компонентов и их последующая солюбилизация в буфере, содержащем 8 М мочевину, позволил получить раствор денатурированного антигена с концентрацией 10 мг/мл. Эффективность рефолдинга разведением составила 75%. После трех этапов хроматографической очистки были получены образцы белка с концентрацией 1,2-1,4 мг/мл, чистотой по ВЭЖХ 98,43%, соответствующие ключевым параметрам качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. Рекомбинантный антиген показал специфическое связывание с образцом Первого международного стандарта ВОЗ и образца СОП № 3 анти-SARS-CoV-2 иммуноглобулинов человека в установленном диапазоне концентраций. CD4⁺Т-лимфоциты эффективно отвечали на обработку рекомбинантным антигеном увеличением продукции IFNγ. Оптимальная концентрация рекомбинантного коронавирусного антигена составила 5 мкг/мл.

Разработанный технологический процесс позволяет получать 5-7 грамм антигена коронавирусного рекомбинантного CorD_PS за один цикл культивирования в 30 л ферментационной среды с ключевыми параметрами качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. В результате исследований специфической иммунологической активности рекомбинантного коронавирусного антигена CorD_PS была подтверждена концепция возможности его использования в качестве диагностикума для определения формирования Т-клеточного иммунного ответа.

Ключевые слова:
SARS-CoV-2, COVID-19, Коронавирусный антиген Cord_PS, Хроматография, Иммуноферментный анализ, CD4+Т-клетки, CD8+Т-клетки, IFNγ, Т-клеточный иммунный ответ, Диагностикум

Аннотация:

Цель исследования: с помощью протонной магнитно-резонансной спектроскопии (1Н МРС) определить возможность неинвазивной оценки влияния креатина и бета-аланина на скорость восстановления уровня рН в мышце после предельной нагрузки.
Материал и методы. В качестве тестируемых биологически активных веществ (БАВ) были взяты креатина моногидрат и бета-аланин, применяемые согласно рекомендациям производителя. На первом этапе были построены калибровочные кривые зависимости рН от величины химического сдвига при снятии 1Н спектров модельных растворов дипептида карнозина для неинвазивного определения внутримышечного рН. Далее проводились эксперименты на лабораторных животных (мыши линии BALB/c) с использованием 9 Тл ЯМР спектрометра Bruker Advance III WB 400 МГц WB (Bruker, Germany). Следующим шагом стали эксперименты на добровольцах по отработке методики оценки эффектов БАВ на прямой четырехглавой мышце бедра. Использовался функциональный тест pwc170 в варианте степ-теста, позволяющий достичь закисления цитоплазмы миоцитов лактатом и оценить эффективность исследуемых БАВ на запас выносливости и функциональность аэробных систем по скорости восстановления уровня рН исследуемой мышцы. Дальнейшее сканирование осуществлялось с помощью высокопольного магнитно-резонансного томографа (Philips Healthcare, Achieva 3.0 Tл, North Braband, the Nederlands) и двух поверхностных кольцевидных радиочастотных катушек SENSE Flex-L.

Результаты. Методом 1Н МРС было оценено влияние перорального приема креатина и бета-аланина на восстановление рН прямой четырехглавой мышцы бедра после закисления цитоплазмы миоцитов лактатом. Эксперименты с участием мелких лабораторных животных показали необходимость разработки и использования более точных методик выделения вокселя и подавления сигнала от жировой ткани при доклинической in vivo 1H спектроскопии для надежной фиксации химических сдвигов пиков карнозина. С помощью полученных для добровольцев протоколов удалось достичь воспроизводимости результатов, оптимальных соотношения сигнал/шум и ширины спектральных пиков карнозина с помощью 1H МРС при 3 Tл в прямой четырехглавой мышце бедра.

Заключение. Полученные с помощью 1Н МРС данные на добровольцах позволяют сделать вывод, что разработанная методика дает возможность неинвазивной оценки влияния БАВ на скорость восстановления уровня рН в мышце после предельной нагрузки в режиме реального времени in vivo.

Ключевые слова:
магнитно-резонансная томография, рН-буферизация, карнозин, БАД

Аннотация:
Т-клеточный иммунный ответ крайне важен при защите организма человека от многих вирусных инфекций. Известно, что он может обеспечить вирусный клиренс и полное выздоровление у пациентов с гуморальным иммунодефицитом. У пациентов с COVID-19 Т-клеточный ответ направлен в основном на структурные белки вируса S, M, N, E, из которых наиболее консервативным является белок нуклеокапсида. Для оценки иммунитета пациентов в отношении коронавирусной инфекции и определения эффективности вакцинных кандидатов необходима разработка оптимального диагностического антигена, используемого для оценки формирования Т-клеточной реакции против антигенных детерминант SARS-CoV-2. Диагностический тест для определения специфической чувствительности организма к инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, должен быть нацелен на консервативные регионы глобальных вариантов SARS-CoV-2. Целью работы была разработка структуры антигена, содержащего консервативные и иммуногенные последовательности структурных белков коронавируса SARS-CoV-2, и получение штамма Escherichia coli - продуцента рекомбинантного белка для последующего использования белка в качестве антигена для оценки Т-клеточного противовирусного иммунитета. Создание последовательности антигена проводили in silico: TepiTool и NetMHCIIpan использовали для прогнозирования и идентификации высокоаффинных эпитопов, охватывающих белки E, M, N, S SARS-CoV-2 и связывающих MHC II. Было сконструировано несколько вариантов рекомбинантных белков-антигенов, из которых выбрали один на основании его физико-химических свойств: изоэлектрической точки, индекса гидрофобности и алифатического индекса, построенной с помощью I-TASSER 3D модели. Последовательность синтезировали и клонировали в вектор pET24a(+). Полученной плазмидой pCorD_PS последовательно трансформировали штаммы E. coli DH5α, затем Rosetta (DE3). Штамм-продуцент рекомбинантного белка E. coli CorD_PS проверяли на наличие и стабильность экспрессии белка-антигена индукцией ИПТГ, также оценивали элиминирование плазмиды, кодирующей синтез рекомбинантного коронавирусного антигена.

В результате разработан антиген, включающий в себя консервативные участки белков S, M, N, E коронавируса SARS-CoV-2, на которые может формироваться Т-клеточный иммунный ответ. Для белка массой 53 kDa предсказана стабильность в водных растворах и изоэлектрическая точка 9,56, что потенциально позволит упростить процесс очистки белка от нативных белков E. coli. Получена плазмидная ДНК pCorD_PS (6695 п.о.), кодирующая клонированный в вектор pET24a(+) синтезированный антиген коронавирусный рекомбинантный. Получен стабильный, продуктивный по коронавирусному рекомбинантному антигену, штамм-продуцент E. coli CorD_PS. Полученный штамм - продуцент рекомбинантного антигена E. coli CorD_PS стабилен, что позволяет перейти к созданию методики очистки антигена и последующей разработке диагностической тест-системы.

Ключевые слова:
SARS-CoV-2, COVID-19, Т-клетки, CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки, Эпитопы, HLA

Аннотация:
В работе рассматривается фармакокинетика двух субстанций, содержащих в качестве активного вещества рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР1). Первая субстанция (ИФР1) содержит собственно рекомбинантный ИФР1, вторая (ИФР2) – ИФР1, транслируемый с плазмидной ДНК, кодирующей ген этого белка IGF-1. Установлено, что при внутримышечном введении ИФР1 время задержки его поступления в кровоток составляет 1.5–2 ч, а ИФР2 – 24–25 ч. Это свидетельствует о наличии различных механизмов накопления данных веществ в системном кровотоке. Максимальное значение концентраций ИФР1 в крови определяется через 5 ч после введения, ИФР2 – через 125 ч после введения. Максимальные значения концентраций этих веществ сопоставимы между собой. Концентрация ИФР1 в крови снижается до исходного значения через 12 ч после его введения, а концентрация ИФР2 – через 216 ч.

Параметры клиренса (Cl) и константы элиминации (Kel) рассматриваемых субстанций также имеют существенные различия, что подтверждает наличие быстрой и медленной динамики снижения их максимальных концентраций после внутримышечного введения. Различная динамика накопления субстанций в крови и их элиминация из кровотока после введения, а также различные значения параметров площади под фармакокинетической кривой (AUCt, AUC∞) демонстрируют, что ИФР2 более продолжительное время находится в системном кровотоке, чем ИФР1. Это имеет существенное значение для формирования и выраженности фармакодинамических эффектов.

Ключевые слова:
Фармакокинетика, Инсулиноподобный фактор роста, Рекомбинантный белок, Плазмидная ДНК, Ген IGF-1, Внутримышечное введение

Аннотация:
Цели настоящего исследования — разработка метода получения рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека на основе прокариотической системы экспрессии и характеристика полученного высокоочищенного белка. Для достижения цели исследования были использованы следующие методы: автоматизированный химический синтез днк, конструирование экспрессионной плазмиды, получение клеток Escherichia coli — продуцента рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека, культивирование полученных клеток-продуцентов с индукцией синтеза рекомбинантного белка изопропил-β-d-тиогалактопиранозидом и лактозой, очистка полученного рекомбинантного белка с применением методов аффинной и катионообменной хроматографии, а также изучение биологической активности полученного белка инсулиноподобного фактора роста-1 на культуре клеток нейробластомы neuro 2a. показано, что при индукции экспрессии в клетках Escherichia coli Bl21, содержащих плазмиду pet28-IGf-1, синтезируется рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста-1 человека, который образует тельца включения. был получен препарат очищенного рекомбинантного белка с чистотой 98 % с использованием методов аффинной и катионообменной хроматографии.

Выход белка составил 6 мг рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека с 1 г сырой биомассы штамма-продуцента. полученный белок обладает способностью к защите клеток нейробластомы neuro 2a от гибели, вызванной депривацией сыворотки в культуральной среде, и стимулирует дифференцировку клеток в нейроны. таким образом, получен высокоочищенный рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста-1 человека, обладающий биологической активностью, пригодный для проведения доклинических исследований. ключевые слова: инсулиноподобный фактор роста-1; рекомбинантный белок; пролиферация нейронов; хроматография.

Ключевые слова:
Инсулиноподобный фактор роста-1; Рекомбинантный белок; Пролиферация нейронов; Хроматография

Аннотация:
Вот уже около ста лет БЦЖ остается единственной широко используемой противотуберкулезной вакциной. Известно, что интенсивность индуцированного БЦЖ иммунного ответа по типу Th1 со временем снижается и сходит на нет в течение 10-15 лет. Это существенно отличает БЦЖ от вакцин, обеспечивающих пожизненную протекцию, таких как вакцины против полиомиелита или кори, и может быть связано с естественным ограничением длительности персистенции индуцированных БЦЖ CD4+T-клеток. Накапливаются данные о недостаточной способности БЦЖ стимулировать длительную иммунологическую память. Ранее в нашей лаборатории на модели заражения лабораторных мышей относительно резистентной к туберкулезу линии С57BL/6 вирулентным лабораторным штаммом Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Rv по результатам определения высеваемости бактерий из органов и продолжительности жизни животных после заражения была продемонстрирована высокая (сравнимая с BCG Russia) протективная активность трех субъединичных вакцинных препаратов. Целью настоящей работы было изучение характеристик и длительности иммунного ответа, индуцируемого наиболее эффективным из этих препаратов. Группы мышей С57BL/6 вакцинировали внутримышечно два раза с двухнедельными интервалами 10 мкг белка, конъюгированного с 200 мкл эмульсии гидроксида алюминия.

Мониторинг иммунного ответа (продукция специфических антител, стимулированная вакцинным белком продукция интерферона-гамма и пролиферация) осуществляли на протяжении 10 месяцев после вакцинации. Установлено, что испытуемый препарат стимулирует у мышей формирование длительной иммунологической памяти к бактериальному антигену. При этом добавление глутоксима смещает спектр иммунологической памяти к «протективному» типу, т.е. стимулирует преобладание клеточного компонента иммунного ответа над гуморальным. Следующим этапом исследования данной вакцины будет изучение эффективности ее применения для ревакцинации после первичной иммунизации БЦЖ.

Ключевые слова:
Туберкулез, Вакцина, Иммунологическая память

Аннотация:

Материалы и методы. В исследование включены 49 пациентов с ГКМП в возрасте от 19 до 86 лет (48, 32±2, 59 года). При анализе выделены три группы в зависимости от возраста и клинического течения ГКМП. Стратификация пятилетнего риска ВСС проведена согласно калькулятору HCM Risk-SCD. Тотальная РНК выделялась из плазмы пациентов. Изучение уровней экспрессии генов микроРНК проводилось методом обратной транскрипции с использованием технологии StemLoop с последующим проведением ПЦР в режиме реального времени с помощью микроРНК-специфических праймеров и набора реагентов фирмы «Синтол» на амплификаторе DTLite. Вычисление относительного уровня экспрессии гена проводили в соответствии со стандартной процедурой 2-ΔCt. Результаты.

В группе симптомного течения до 44 лет (n= 15) риск ВСС составил от 2, 44 до 20, 71%(7, 37±1, 34) и был выше (р= 0,011) чем в группе бессимптомного течения до 44 лет (n= 6), в которой риск варьировался от 1, 01 до 4, 77%(2, 52±0, 66) и выше (р= 0,001), чем в группе симптомного течения у пациентов старше 44 лет (n= 28), в которой риск варьировался от 1, 02 до 7, 59%(2, 96±0, 33). В группе симптомного течения до 44 лет зарегистрирован один случай ВСС в возрасте 24 лет при расчетном риске 13, 07%, в четырех случаях в рамках профилактики ВСС имплантирован кардиовертер-дефибриллятор (ИКД), еще четыре пациента имеют показания к ИКД. Уровень микроРНК-21 в группе симптомного течения до 44 лет варьировался от 2, 46 до 337, 79 (55, 02±22, 45) и был выше (p= 0,002), чем в группе бессимптомного течения до 44 лет, в которой уровень микроР-НК-21 составил от 1, 62 до 5, 28 (3, 12±0, 8) и выше (p= 0,002), чем в группе симптомного течения старше 44 лет, в которой уровень микроРНК-21 варьировался от 1, 07 до 119, 43 (10, 86±4, 34).

Выводы. Повышенный уровень циркулирующей микроРНК-21 обнаружен у молодых пациентов с симптомным течением ГКМП и высоким расчетным риском ВСС.

Аннотация:

Введение. Матриксный белок p17 ВИЧ-1 является ключевым фактором иммунопатогенеза СПИДа, он играет важнейшую роль во всех этапах развития вируса и прогрессии заболевания. Взаимодействие моноклональных антител к различным эпитопам белка p17 с поверхностью ВИЧ-1 инфицированных клеток приводит к уменьшению продукции вирусных частиц. Также антитела к некоторым эпитопам матриксного белка обладают прямой вирусней-трализующей активностью, ингибируя инфицирование чувствительных клеточных линий после взаимодействия с вирионами.

Цель и задачи. Целью данного исследования являются разработка и получение моноклонального антитела, специфичного к эпитопу белка р17 ВИЧ-1. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: создание штамма-продуцента рекомбинантного моноклонального антитела, а также разработка технологии получения фармацевтической субстанции на его основе.

Материалы и методы. Синтез и клонирование гена, кодирующего рекомбинантный белок, осуществляли методом ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов. Для создания штамма-продуцента рекомбинантного моноклонального антитела использовали высокопродуктивную линию клеток яичника китайского хомячка CHO-K1. Очистку субстанции моноклонального антитела проводили последовательно с использованием обратно-фазовой и гель-фильтрационной хроматографии.

Основные результаты. Была разработана конструкция моноклонального антитела специфичного к белку р17 ВИЧ-1. Был получен высокопродуктивный штамм рекомбинантного моноклонального антитела. Была разработана технология выделения и хроматографической очистки субстанции моноклонального антитела.

Заключение. Таким образом, была осуществлена разработка и получение высокоочищенной субстанции моноклонального антитела, специфичного к эпитопу белка р17 ВИЧ-1. На основе данной субстанции планируется создание лекарственного средства для лечения ВИЧ-инфекции. На данный момент проводится изучение иммуногенных и протективных свойств полученного препарата.

Аннотация:

Цели исследования: синтез гена, кодирующего нетоксичный вариант дифтерийного токсина CRM197, исследование его экспрессии в клетках Escherichia coli, получение штамма бактерий - продуцента ре-комбинантного CRM197, разработка метода очистки данного белка из биомассы бактерий.

Материалыи методы исследования. Ген белка CRM197 синтезировали химико-ферментативным методом. Конструирование и сборку экспрессионного вектора проводили стандартными методами генетической инженерии. Продукцию CRM197 клетками Escherichia coli изучали методами электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттинга. Рекомбинантный CRM197 выделяли с помощью металлохелатной хроматогра-фии.

Результаты. Применение экспрессионного вектора pColdll позволило получить продукцию реком-бинантного белка при понижении температуры культивирования клеток с 37 до 16°С. Разработан метод очистки рекомбинантного CRM197, получен препарат белка с чистотой 97%, который имел молекулярную массу 60 кДа и связывался в иммуноблоте с поликлональными антителами к дифтерийному токсину.

Заключение. Успешная продукция рекомбинантного белка CRM197 была достигнута с использованием вектора ColdII при пониженной температуре культивирования клеток. Очищенный белок обладает ну-клеазной активностью, что свидетельствует о его правильном фолдировании. И олучение очищенного ре-комбинантного CRM197 позволит использовать данный белок при конструировании конъюгатных вакцин.

Ключевые слова:
Дифтерийный токсин, CRM197, Промотор cspA, Escherichia coli, Металлохелатная хроматография

Аннотация:
By now there is no effective treatment for a number of socially significant bacterial and fungal diseases. β-(1→3)-glucans are the principal components of the cell wall of fungi, including Candida albicans, Aspergillusfumigatus and other. At the same time, β-(1→3)-glucans are absent in mammals and man, that makes them promising components of carbohydrate-protein conjugated vaccines for the prevention and treatment of fungal infections. Alginic acid, constructed of β-(1→ 4)-linked mannuronic acid are extracellular polysaccharides produced by Pseudomonas aeruginosa. The protein CRM197 is a non toxic derivative of diphtheria toxin, which is widely used as a safe carrier in conjugated vaccines. The purpose of this study was to investigate the antigenic activity of experimental samples of the conjugated vaccines based on synthetic oligosaccharide ligands and CRM197 carrier protein in the competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Two-time immunization Balb/c mice with experimental samples of the conjugated vaccines induced the formation of high titers of specific antibodies. High antibody’s avidity to their oligosaccharide ligands was shown in competitive ELISA. These data suggest the relevance of further preclinical trials of the conjugated antifungal vaccine against Candida and Aspergillus and antibacterial vaccine against Pseudomonas.

Ключевые слова:
Antigen activity, Aspergillus fumigatus, Balb/c Mice, Candida albicans, Conjugated vaccines, ELISA, Pseudomonas aeruginosa, Recombinant CRM197

Аннотация:

Цель исследования: синтез гена, кодирующего сконструированный ранее искусственный белок анторекс-антагонист рецептора орексина ОхR1, изучение его экспрессии в клетках Escherichia coli и разработка метода очистки данного белка из лизатов бактериальных клеток. Использовались методы химико-ферментативного синтеза ДНК, генетической инженерии, селекции и хроматографической очистки белков.

Результаты: синтезирован ген, кодирующий белок анторекс, последовательно получены содержащая данный ген плазмидная ДНК рЕТ-antorex и штамм бактерий Escherichia coli BL21 (pЕT-аntorex)-стабильный продуцент рекомбинантного белка анторекс, разработаны методы культивирования штамма-продуцента и хроматографической очистки белка анторекс с помощью обратнофазной и ионообменной хроматографии. Произведено культивирование полученного штамма-продуцента в ферментере объемом 10 литров. Наработана опытная партия белка анторекс массой 480 мг с чистотой 97, 5%.

Заключение: разработанные методы продукции искусственного белка анторекс в бактериальных клетках и его очистки позволяют нарабатывать данный белок для проведения доклинических и клинических испытаний.

Ключевые слова:
Рецептор орексина, Антагонист, Экспрессия в Escherichia coli, Очистка белка

Аннотация:
Вирус гриппа вызывает высококонтагиозное заболевание людей, птиц и млекопитающих. Подсчитано, что ежегодно от эпидемий гриппа погибает от 250 000 до 500 000 человек и эта цифра может увеличиваться до 1 млн в период возможных пандемий вируса гриппа. Самым эффективным путем профилактики болезни или ее тяжелых последствий является вакцинация. На данный момент существует несколько подходов для создания противогрипозных вакцин, но они имеют ряд недостатков, которые снижают общую эффективность вакцинных препаратов.

Соответственно, создание универсальной вакцины, способной обеспечить надежную защиту от существующих и возможных реассортантных штаммов вируса гриппа, на данный момент является приоритетной задачей. Использование вакцин на основе рекомбинантных белков позволяет избежать рисков, связанных с введением вируса в организм, пусть и инактивированного. Данная работа посвящена получению высокоочищенного гибридного рекомбинантного белка, включающего фрагменты белков гемагглютинина вирусов гриппа А и В, а также компоненты флагеллина в качестве адъюванта. Указанные фрагменты белков представляют собой консервативные части гемагглютининов H1, H3, H5 и В, к которым в процессе естественной инфекции образуются специфичные антитела, перекрестно реагирующие с гомологичными эпитопами среди различных штаммов вирусов гриппа А и В. Выбранные участки белков наиболее иммуногенны. Их присутствие обеспечивает как В-клеточный, так и Т-клеточный иммунный ответ.

Использование эпитопов нескольких белков позволяет увеличить эффективность вакцины, а использование гибких мостиков между эпитопами позволяет сохранить правильную пространственную укладку белка и, соответственно, обеспечивает полноценное функционирование каждого эпитопа. Гибридный белок, содержащий Ви Т-клеточные эпитопы разных субтипов вирусов гриппа А и В, а также флагеллин, позволят обеспечить сильный иммунный ответ при меньших затратах на производство. Нами был смоделирован гибридный рекомбинантный белок Flu-Chim, содержащий иммуногенные эпитопы вирусов гриппа А/H1N1, A/H3N2, A/H5N1 и В, слитые с фрагментами флагеллина. Был создан высокопродуктивный штамм-продуцент, на основе клеток E. coli BL21(DE3). Была изучена экспрессия гибридного гена flu-chim при различных условиях индукции. Также был получен высокоочищенный гибридный рекомбинантный белок Flu-Chim с использованием металлоаффинной хроматографии. Чистота белка после финальной стадии очистки составила 98%. В дальнейшем планируется изучение иммунологических свойств полученного рекомбинантного белка.

Ключевые слова:
Вирус гриппа, Универсальная вакцина, Рекомбинантный белок, Гемагглютинин, Иммуногенность, Хроматография

Аннотация:
В настоящее время отсутствуют эффективные средства лечения ряда социально значимых бактериальных и грибковых заболеваний. β-(1→3)-глюканы, то есть полисахариды, состоящие из остатков глюкозы, связанных между собой β-(1→3)-гликозидными связями, являются принципиальными компонентами клеточной стенки грибов и дрожжей, в том числе таких опасных возбудителей госпитальных инфекций, как Candida albicans, Aspergillus fumigatus и других. В то же время β-(1→3)-глюканы отсутствуют в организме млекопитающих и человека, что делает их перспективными компонентами конъюгированных углевод-белковых вакцин для профилактики и лечения грибковых инфекций. Белок CRM197 является производным дифтерийного токсина и характеризуется единичной мутацией, а именно заменой глицина на глутаминовую кислоту в положении 52, что полностью элиминирует его токсичность. Белок CRM197 нетоксичен, тем не менее сохраняет те же воспалительные и иммуностимулирующие свойства, что и дифтерийный токсин. В настоящее время данный белок широко используется в качестве безопасного носителя в конъюгированных вакцинах. Классическим способом получения CRM197 является выделение их из лизогенных культур Corynebacterium diphtheriae. Альтернативой классическому способу получения CRM197 является экспрессия его гена в клетках Escherichia coli, Bacillus subtilis и Pseudomonas fluorescens.

Преимущество использования Escherichia coli в качестве продуцента состоит в том, что данный метод является более простым и дешевым и позволяет получать рекомбинантный CRM197 в короткие сроки с использованием непатогенного микроорганизма. Целью данного исследования было изучение антигенной активности экспериментальных образцов конъюгированных вакцин на основе синтетических олигосахаридных лигандов и белка-носителя CRM197 в реакции конкурентного ИФА. Двукратная иммунизация экспериментальными образцами конъюгированных вакцин на основе олигосахаридных лигандов и белка-носителя CRM197 лабораторных мышей линии Balb/c вызывает формирование высокого титра специфических антител. Все исследованные образцы конъюгированных вакцин на основе олигоглюкозидов с различным содержанием мономерных звеньев в цепи (пентасахариды, гептасахариды, наносахариды, а также ундекасахариды) при их двукратном введении вызывали формирование у иммунизированных животных титра антител на уровне 1:51200. Высокая авидность формирующихся антител к своим олигосахаридным лигандам была показана в реакции конкурентного ИФА.

Полученные данные говорят о целесообразности дальнейших доклинических исследований экспериментальных образцов конъюгированных вакцин против грибов Candida и Aspergillus, а также выбора наиболее иммуногенного и эффективного варианта вакцины из исследуемых.

Ключевые слова:
Конъюгированные вакцины, Рекомбинантный CRM197, Антигенная активность, Мыши BALB/C

Аннотация:
Цель: исследование экспрессии рекомбинантного инсулиноподобного -актора роста-1 (ИФР-1) человека при внутримышечном введении мышам плазмидной ДНК, экспрессирующей данный белок, с помощью электропорации. Материалы и методы исследования. Для создания экспрессионной плазмиды использовали вектор pcDNA3, в который с помощью стандартных методов генной инженерии ввели синтетический ген, кодирующий ИФР -1 человека. Введение плазмидной ДНК в мышцы мышей in vivo проводили путем электропорации, осуществл емой с помощью генератора импульсов собственной разработки. Концентрацию ИФР-1 в сыворотке крови измеряли с помощью твердо-азного иммуно-ерментного анализа.

Результаты. Сконструирована плазмида pcDNA3igf-1,о беспечивающая продукцию ИФР-1 в клетках млекопитающих, получен штамм бактерий E. coli DH10(pcDNA3igf-1) - продуцент данной плазмиды. В результате подбора условий электропорации при внутримышечном введении очищенной плазмиды pcDNA3igf-1 мышам линии Balb/c была достигнута максимальная концентрация ИФР-1 в сыворотке крови, равна 324 нг/мл, что превышает контрольную величину в 3,44 раза, при этом повышенная концентрация ИФР-1 в сыворотке крови сохран лась в течение 7 дней.

Заключение: внутримышечное введение плазмидной ДНК, экспрессирующей ИФР-1 человека, усиленное электропорацией, способно повысить концентрацию данного гормона в крови мышей в течение 7 суток.

Ключевые слова:
Инсулиноподобный фактор роста 1, Плазмида, Экспрессия in vivo

Аннотация:
К сегодняшнему дню назрела необходимость разработки вакцин нового поколения как наиболее эффективных иммунопрофилактических средств борьбы с туберкулезом. Наибольшую поддержку в мире находит стратегия гетерологичной вакцинации, в рамках которой для праймирования иммунной системы предлагается использовать вакцину БЦЖ или ее улучшенные аналоги, либо аттенуированные штаммы M. tuberculosis, а для последующих бустерных вакцинаций субъединичные или векторные вакцины, содержащие протективные белки микобактерий. Целью настоящего исследования была оценка протективных свойств новой вакцины на основе рекомбинантных бактериальных белков Ag85, ТВ10 и FliC. Мы использовали модель аэрозольного заражения вакцинированных и интактных лабораторных мышей линии С57BL/6 вирулентным лабораторным штаммом M. tuberculosis H37Rv и определяли высеваемость бактерий из органов и продолжительность жизни животных после заражения.

В результате были выявлены три варианта вакцины, обладающие в нашей модели сравнимой с БЦЖ протективной активностью. Наиболее перспективный вариант будет использован для последующих доклинических испытаний.

Ключевые слова:
Туберкулез, Вакцина, Иммунитет, Рекомбинантные антигены, Протекция, Микобактерия

Аннотация:
Изучено влияние профилактического и терапевтического введения отечественного рекомбинантного флагеллина на показатели выживаемости белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых воздействию летальных доз рентгеновского излучения (СД60-100/30). Установлено, что из всех изученных схем введения рекомбинантного флагеллина (±15-30 мин,±2 ч,±24 ч к радиационному воздействию) наиболее эффективно противолучевая активность препарата проявлялась в условиях его профилактического введения за 15-30 мин до облучения.

Однократное внутрибрюшинное введение в дозе 1 мг/кг повышало выживаемость мышей, облучённых в дозах 7, 5 и 8, 5 Гр на 37 и 80% соответственно (р< 0, 05). При этом расчётное значение СД50/30 возрастало с 7, 04±0, 01 Гр (95% ДИ: 6, 99; 7, 10) у мышей, подвергнутых радиационному воздействию без применения флагеллина, до 11, 7±0, 28Гр (95% ДИ: 9, 43; 14, 1). 30-суточная выживаемость мышей, облучённых в дозе 8 Гр, при введении препарата в дозе 1 мг/кг за 15-30 мин до лучевого воздействия возрастала до 53%, в дозе 2 мг/кг-до 87%(р< 0, 01); в контрольной группе выжило 20% животных. Выявлено значимое модифицирующее влияние флагеллина в условиях профилактического введения в короткие сроки до облучения на динамику радиационно-индуцированной потери массы тела мышей и на силу корреляционной связи между степенью снижения массы тела облучённых мышей и их продолжительностью жизни (коэффициент корреляции Спирмена составил-0,055; в контрольных группах-0, 94, р< 0,001).

Также было показано, что внутрибрюшинное введение рекомбинантного флагеллина в дозе 2 мг/кг хорошо переносится мышами, не оказывает выраженного побочного действия и не ухудшает общего состояния животных. Полученные результаты подтверждают перспективность проведения дальнейших исследований, направленных на разработку флагеллиноснованных средств химической защиты от лучевого поражения.

Ключевые слова:
Рекомбинантный флагеллин, Радиозащитная эффективность, Мыши, Выживаемость, Профилактическое введение, Терапевтическое введение

Аннотация:
Рак шейки матки является одним из наиболее распространенных видов новообразований, занимая 7 место в мире среди всех злокачественных опухолей, и вторым по распространенности онкологическим заболеванием у женщин. Необходимым условием развития рака шейки матки является наличие в клетке ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ): ДНК ВПЧ найдено в 99,7% случаев заболевания. Помимо рака шейки матки, ДНК ВПЧ обнаружено в 85% случаев рака прямой кишки, 50% рака вульвы, вагины и пениса, 20% ротоглоточного рака и 10% гортани и рака пищевода. В России количество женщин, вновь заболевших раком шейки матки в 2009 г., составляет 14 000 человек. По сравнению с 1999 г. рост заболеваемости населения составил 19%. Наиболее эффективной мерой в профилактике практически любой инфекции признана вакцинация.

В настоящее время в России доступны две вакцины (Церварикс и Гардасил) против вируса папилломы человека, производимые в Бельгии и Нидерландах соотвественно. Церварикс представляет собой бивалентную вакцину, состоящую из вирусоподобных частиц, образуемых при самосборке капсидного вирусного белка L1 ВПЧ типа 16 и 18 (онкогенные штаммы вируса, найденные примерно у 70% больных раком шейки матки). В этом препарате белок L1 ВПЧ экспрессируется в рекомбинантном бакуловирусном векторе; вируспоподобные частицы каждого вирусного штамма производятся отдельно и затем объединяются в один препарат. Гардасил аналогичен Цервариксу, однако в качестве продуцентов используются дрожжи S. cerevisiae, и в препарат добавлены вирусоподобные частицы вирусов папилломы человека неонкогенных типов 6 и 11. Таким образом Гардасил является квадривалентной ВПЧ-6/11/16/18 вакциной. Эти вакцины весьма эффективны в предотвращении инфицирования вирусом и не имеют значимых побочных эффектов, однако они обладают и рядом минусов. В первую очередь это высокая стоимость из-за необходимости их экспрессии в эукариотических клетках. Во-вторых, это их штаммоспецифичность, из-за которой вакцины полностью эффективны только против штаммов вируса, представленных в вакцине. В-третьих, это отсутствие терапевтической (лечение уже установившейся инфекции) ценности данных вакцин. В литературе показано, что N-конец вирусного белка L2 способен генерировать нештаммоспецифичные нейтрализующие антитела, блокирующие проникновение вируса в клетку.

Белок Е7 является вирусным онкогеном, отвечающим за неконтролируемую пролиферацию зараженных клеток, что в хронических случаях приводит к опухолевой трансформации. Этот белок по причине своей незаменимости, как для жизненного цикла вируса, так и для поддержания опухолевого фенотипа раковых клеток, является привлекательной целью терапевтической вакцины. Таким образом, недостатков Гардасила и Церварикса была бы лишена вакцина на основе белков L2 и E7 вируса папилломы человека. Создан штамм-продуцент белка на основе клеток E. coli, белок очищен в восстановительных денатурирующих условиях металлоаффинной хроматографией и рефолдирован путем последовательного удаления мочевины и меркаптоэтанола.

Ключевые слова:
Вакцина ВПЧ, Папиллома, Вирус Папилломы Человека, Белок L2, Белок E7, Фолдинг

Аннотация:
Ротавирусы являются одной из ведущих причин возникновения тяжелой диареи, приводящей к дегидратации организма у детей младшего возраста. Большинство детей инфицируется до достижения 5-летнего возраста. В России заболеваемость ротавирусной инфекцией постоянно растет, что объясняется как увеличением числа случаев инфицирования, так и совершенствованием способов диагностики данного заболевания. Иммунитет к ротавирусной инфекции нестойкий, поэтому заболевание может повторяться в течение жизни.

Невосприимчивость у переболевших обусловлена формированием не только IgMи IgG-, но и IgA-специфичных антител. На данный момент на мировом рынке отсутствуют препараты с прямым противоротавирусным действием, ввиду этого самым эффективным способом борьбы с данным заболеванием считается своевременная вакцинация. Существующие в настоящее время вакцины для профилактики ротавирусной инфекции основаны на живых аттенуированных штаммах ротавируса человеческого и/или животного происхождения, которые размножаются в кишечнике человека. Использование вакцин на основе рекомбинантных белков позволяет избежать рисков, связанных с введением вируса в организм, пусть и аттенуированного. В данной работе изучали протективную активность кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции. Активный агент кандидатной вакцины – белок FliCVP6VP8 – включает фрагмент белка VP6, фрагмент белка VP8 ротавируса А, а также компоненты флагеллина Salmonella typhimurium FliC в качестве адъюванта, компоненты соединены гибкими мостиками. Целью данного исследования было изучение эффективности кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции на основе рекомбинантного FliCVP6VP8 на модели ротавирусной инфекции на лабораторных мышах линии Balb/c. Был показан высокий уровень защиты, возникающий при двукратном внутримышечном введении кандидатной вакцины.

Полная защита от мышиного ротавируса EDC после его перорального введения иммунизированным кандидатной вакциной против ротавирусной инфекции животным ассоциировалась с продукцией вирусспецифичных IgA и IgG в кишечнике животных и в сыворотке крови. Эффективность кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции на основе рекомбинантного белка FliCVP6VP8 сопоставима с таковой коммерческой вакцины Rotarix® (Glaxo Smith Kline) при большей безопасности кандидатной вакцины, за счет отсутствия живого вируса в ее составе. Таким образом, полученные результаты говорят о целесообразности проведения дальнейших доклинических испытаний кандидатной противоротавирусной вакцины на основе рекомбинантного белка FliCVP6VP8.

Ключевае слова:
Ротавирусный гастроэнтерит, Вакцина, Протективность, Лабораторная модель ротавирусной инфекции

Аннотация:
Разработка вакцин против стрептококков группы В, занимающих существенное место в структуре инфекционной заболеваемости человека, в настоящее время является важнейшей задачей современной медико-биологической науки. В задачи исследования входило изучение иммуногенных и протективных свойств четырех оригинальных химерных рекомбинантных полипептидных вакцин, представляющих собой комбинацию иммунодоминантных фрагментов поверхностных белков СГВ-Вас, С5а пептидазы, ScaAB, СspA и SspB1. Гибридные молекулы были созданы с применением технологии, включающей химический синтез полноразмерной ДНК молекулы, ее клонирование в экспрессионных векторах с последующей экспрессией белков в эффективных продуцентах.

На экспериментальной модели мышей проведен сравнительный анализ иммуногенеза и уровня поствакцинальной защиты. Установлено, что все сконструированные белки были иммуногенны, однако обладали различной способностью стимулировать иммунный ответ, специфичный в отношении СГВ, и различную способность обеспечивать защиту в условиях модельной инфекции.

Ключевые слова:
Вакцины, Рекомбинантные химерные белки, Факторы патогенности, Стрептококки группы В

Аннотация:
Белок CRM197 является одним из нетоксичных вариантов дифтерийного токсина, характеризующийся единичной мутацией, а именно, заменой глицина на глутаминовую кислоту в положении 52. Белок CRM197 является перспективным адъювантом нового поколения, который может быть успешно использован в вакцинных и терапевтических препаратах. Классическим способом получения дифтерийного токсина и его нетоксичных вариантов является продукция в клетках Corynebacterium diphtheria. Преимущество использования E.coli в качестве продуцента заключается в том, что данный метод является более простым и дешевым, и позволяет получать рекомбинантный CRM197 в короткие сроки с использованием непатогенного микроорганизма.

В ходе исследования разработан состав кандидатной субстанции CRM197 на основе анализа физико-химических свойств белка, а также специфики его применения в составе конъюгированных вакцин. В субстанции рекомбинантного белка CRM197 присутствуют примеси белка штамма-продуцента 0,054 нг/мкг белка CRM197, ДНК штамма-продуцента 1,26 пг/мкг белка CRM197, а также остаточные эндотоксины менее 0,078 EU на 1 мг белка. Таким образом, белок CRM197, являющийся нетоксичным вариантом дифтерийного токсина, представляет собой перспективный адъювант нового поколения, который может быть успешно использован в вакцинных и терапевтических препаратах. Использование трехступенчатой очистки позволило получить рекомбинантный белок CRM197 фармацевтически приемлемого качества. Данный метод имеет перспективы по внедрению в производственную практику.

Ключевые слова:
Рекомбинантный CRM197, Субстанция, Адъювант, Конъюгированные вакцины

Аннотация:

Введение. Ротавирусы являются одной из ведущих причин возникновения тяжелой диареи, приводящей к дегидратации организма у детей младшего возраста. Ротавирусы повреждают энтероциты, расположенные на микроворсинках тонкого кишечника, что приводит к снижению абсорбции и диарее. Иммунитет к ротавирусной инфекции нестойкий, поэтому заболевание может повторяться в течение жизни. Невос приим чи вость у переболевших обусловлена формированием не только IgM и IgG, но и IgA антител. В настоящее время самым эффективным способом борьбы с ротавирусной инфекцией считается своевременная вакцинация.
Лицензированные противоротавирусные вакцины основаны на живых аттенуированных штаммах ротавируса человеческого и/или животного происхождения, которые размножаются в кишечнике человека. Активный агент кандидатной вакцины — белок FliCVP6VP8 — включает фрагмент белка VP6, фрагмент белка VP8 ротавируса А, а также компоненты флагеллина Salmonella typhimurium FliC в качестве адъюванта, компоненты соединены гибкими мостиками. Представленные фрагменты являются консервативными частями белков VP6 и VP8, к которым в процессе естественной инфекции образуются специфичные антитела.

Цель исследования: изучение эффективности кандидатной вакцины против ротавирусной инфекции на основе рекомбинантного FliCVP6VP8 на модели ротавирусной инфекции на лабораторных мышах.

Заключение. Полученные результаты говорят о целесообразности проведения дальнейших доклинических испытаний кандидатной противоротавирусной вакцины на основе рекомбинантного белка FliCVP6VP8.

Аннотация:
A chimeric protein, designated PSPF (Pneumococcus Surface Proteins and Flagellin) was constructed fromconservative and immunogenic fragments of S. pneumoniae surface proteins PspA, Spr1875, PsaA and theSalmonella typhiurium flagellin terminal domains FliC1, FliC2 functioning as adjuvant. PSPF was highlyimmunogenic in mice and induced protection from virulent S. pneumonia strains. All the subtypes of S. pneumoniaeunder study were recognized by anti-PSPF sera. Thus, the chimeric recombinant PSPF protein is a promisingvaccine candidate for immunization of humans against S. pneumoniae.

Ключевые слова:
Pneumonia; Streptococcus pneumonia; Chimericprotein; Recombinant vaccine; TLR-5; Flagellin

Аннотация:
Белок CRM197 является нетоксичным производным дифтерийного токсина и характеризуется одной мутацией, а именно, заменой глицина на глутаминовую кислоту в положении 52. Белок CRM197 является перспективным адъювантом нового поколения, который может быть успешно использован в вакцинных и терапевтических препаратах. Классическим способом получения дифтерийного токсина и его нетоксичных производных является продукция в клетках Corynebacterium diphtheriae. Преимущество использования E. coli в качестве продуцента состоит в том, что данный метод является более простым и дешевым, и позволяет получать рекомбинантный CRM197 в короткие сроки с использованием непатогенного микроорганизма. В данной работе использовался запатентованный высокопродуктивный штамм-продуцент рекомбинантного CRM197 на основе клеток E. coli.

В ходе исследования подобран оптимальный протокол индукции экспрессии гена crm197, разработан метод получения высокоочищенного препарата рекомбинантного CRM197 путем последовательного применения ионообменной, гидрофобной и молекулярно-ситовой типов хроматографии.

Ключевые слова:
Рекомбинантный белок, Адъювант, Конъюгированные вакцины, Дифтерийный токсин

Аннотация:
На сегодняшний день туберкулез является одним из самых распространенных и опасных заболеваний в мире. Туберкулез сегодня, как и в начале XX в. основная причина смерти от инфекционных заболеваний, вызванных бактериальными агентами. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в 2013 г. в мире туберкулезом заболело более 9 млн человек и около 1,5 млн заболевших погибло. Возбудителем туберкулеза является бактерия Mycobacterium tuberculosis, реже родственные ей виды Mycobacterium bovis и Mycobacterium africanum. В основном в результате заражения бактериальная инфекция поражает легкие, однако возможно развитие заболевания и в других органах и тканях. На сегодняшний день эффективная вакцинация признана наиболее перспективной стратегией борьбы с туберкулезом. Однако на данный момент единственной зарегистрированной и разрешенной к применению противотуберкулезной вакциной является вакцина БЦЖ. В мире существует много разновидностей этой вакцины; все они производные одного штамма и незначительно различаются между собой по эффективности. Сомнительная эффективность вакцинации БЦЖ и побочные эффекты заставляют научное сообщество разрабатывать новые средства профилактики туберкулеза.

Можно выделить ряд направлений разработки новых противотуберкулезных вакцин, одним из которых является создание субъединичных вакцин на основе рекомбинантных белков. Достоинства субъединичных вакцин заключаются в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные эффекты в организме. На данный момент идентифицирован ряд антигенов Mycobacterium tuberculosis, перспективных для использования в качестве компонентов новых вакцин. Так, культуральный фильтрат Mycobacterium tuberculosis содержит иммунодоминантные секретируемые антигены, из которых одним из наиболее изученных является белок TB10.4. Белок TB10.4 специфичен для микобактерий, распознается на ранней стадии туберкулезной инфекции и способствует пролиферации лимфоцитов, ответственных за продукцию IFNγ. Белок TB10.4 также обладает адъювантным действием при введении в комплексе с белками микобактерий. Учитывая эти свойства, рекомбинантный белок TB10.4 может быть использован для создания новых кандидатных вакцин против туберкулеза.

Ключевые слова:
Рекомбинантный TB10.4, Вакцины, Туберкулез, Штамм-продуцент, Культура клеток, Способ очистки

Аннотация:
Ротавирусная инфекция основная причина возникновения тяжелой диареи, приводящей к дегидратации организма у младенцев и детей младше пяти лет. В течение жизни случаи ротавирусного гастроэнтерита могут повторяться. Ввиду отсутствия препаратов с прямым противоротавирусным действием самым эффективным способом борьбы с данным заболеванием считается своевременная вакцинация. Существующие противоротавирусные вакцины основаны на живых аттенуированных штаммах ротавируса человеческого и/или животного происхождения, которые размножаются в кишечнике человека, что может приводить к развитию различных осложнений.

В данной работе изучали иммуногенность рекомбинантных гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 активных агентов кандидатной вакцины против ротавируса. В ходе исследования получены высокоочищенные препараты белков в нативных условиях, а также показана их высокая антигенная активность в экспериментах с лабораторными мышами линии Balb/c.

Ключевые слова:
Ротавирусный гастроэнтерит, Вакцина, Рекомбинантные гибридные белки

Аннотация:
Ротавирусная инфекция является одной из наиболее распространенных причин детских энтеритов. Инфицирование этим вирусом зачастую приводит к выраженной дегидратации организма ребенка. Обезвоживание организма сопровождает многие инфекционные заболевания и является самой распространенной причиной смертности. На сегодняшний день самым эффективным способом профилактики ротавирусной инфекции считается своевременная вакцинация. Однако вакцинация проводится с применением живых аттенуированных вакцин, что может приводить к развитию различных осложнений. Создание кандидатной вакцины в этой работе осуществлялось на основе рекомбинантных гибридных белков, являющихся активными агентами при развитии протективного иммунитета против ротавируса. В ходе исследования созданы гибридные белки VP6VP8 и FliCVP6VP8, подобран оптимальный протокол индукции генов, кодирующих данные белки. Белки VP6VP8 и FliCVP6VP8 наработаны и очищены с использованием металлоаффинной хроматографии.

Ключевые слова:
Ротавирусный гастроэнтерит, Вакцина, Рекомбинантные гибридные белки

Аннотация:

Background
Recombinant hemagglutinin (rHA) and neurominidase (rNA) developed in our investigation are amino acid sequence consensus variants of H1N1 2009 subtype influenza virus strain, also including immunogenic epitopes typical for other influenza virus subtypes (H3N1 and H5N1). Substitutions were made: typical for Russian virus isolates (in HA – S220T, NA – D248N) and in active centers of molecules – R118L, R293L, R368L; C92S, C417S to increase recombinant proteins stability in E. coli. The aim of the present work was to study immunogenicity of the obtained rHA and rNA.

Material/Methods
Fragments aa 83–469 of NA and aa 61–287 of HA were chosen because they include the main B-cell epitopes and are the minimal structures for correct folding of target proteins. The designed nucleotide sequences were synthesized and purified and the expression of rNA and rNA were analyzed. For immunization and virus challenge we used influenza viruses A/California/04/2009 (H1N1), A/PR/8/34 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2), A/Chicken/Kurgan/05/2005 R.G. (H5N1), and B/Florida/04/2006. Specific IgG levels were determined by ELISA in 96-well ELISA plates. Significant differences of survival in mouse groups were analyzed by Mantel-Cox (log-rank) and Gehan-Breslow-Wilcoxon tests.
Results
The obtained results demonstrate the high immunogenicity and ability of indicated proteins mixture to provide similar cross-protection against influenza viruses of the H1N1 subtype.
Conclusions
The data obtained suggest efficient pluripotent vaccine creation based on HA and NA conservative regions.

Ключевые слова:
Conservative epitopes, Immunogenicity, Influenza virus, Recombinant haemagglutinin, Recombinant neuraminidase

Аннотация:
Целью настоящего исследования явилось сравнение фармакокинетических и фармакодинамических показателей трёх лекарственных форм нового лекарственного препарата на основе плазмидной ДНК pCIGF для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии. Доклиническое исследование фармакологических свойств и лекарственной безопасности препарата проведено на мышах, которым препарат вводился однократно и двукратно. Введение жидкой и лиофилизованной форм препарата проводили внутримышечно, гелевая форма применялась наружно. Анализировали различные органы: мозг, сердце, кровь (лейкоцитарную массу и сыворотку), лёгкое, печень, почку, селезёнку, мышцу (место укола) на наличие в них плазмиды в зависимости от времени после введения.

Ключевые слова:
Фармакокинетика, Фармакодинамика, Регенеративная генная терапия

Аннотация:
Работа посвящена созданию лекарственного препарата для регенеративной генной терапии повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии (механические, химические, термические травмы, местные радиационные и электрические повреждения и т. п.). Эффективность препарата определяется его способностью локально экспрессировать инсулиноподобный фактор роста человека (IGF-1), который стимулирует пролиферацию и активную регенерацию клеток и тканей организма. Лечение ран с использованием данного препарата превосходит известные способы лечения ран, основанные на стимуляции регенераторных процессов. Проанализированы условия получения стабильных лиофильно-высушенной и жидкой форм препарата ДНК рCIGF, проведен подбор компонентов, образующих гель, в которых плазмидная ДНК способна сохранять структурную и функциональную стабильность. Приведены данные о биологической активности препарата в зависимости от условий получения и хранения препарата. Установлено, что наиболее оптимальной лекарственной формой, стабильной и сохраняющей активность при долговременном хранении, является лиофилизированный препарат, содержащий плазмидную ДНК pCIGF.

Разработанная лекарственная форма может применяться в терапии ран различного генеза (механические, химические, термические травмы, местные радиационные и электрические повреждения и т. п.) путем нанесения на поврежденные участки и окружающие кожные покровы. Представленные данные позволят существенно повысить эффективность действия геннотерапевтических препаратов для лечения повреждений поверхностных тканей человека различной этиологии.

Ключевые слова:
Генная терапия, Инсулиноподобный фактор роста, Регенерация

Аннотация:
Цель работы — анализ регенерационной активности генно-терапевтического препарата на основе плазмиды, содержащей вектор, экспрессирующий инсулиноподобный фактор роста человека (pCIGF), в условиях экспериментальной модели ран различного происхождения (резаная и операционная раны). Для оценки специфической активности препарата проанализированы уровни экспрессии генов плазмиды pCIGF в тканях животных после аппликации генно-терапевтической композиции в двух лекарственных формах (лиофилизат и гель). Скорость заживления анализировалась на экспериментальной модели резаной и операционной раны у крыс, также проводилась гистологическая оценка биоптатов. Показано, что применяемые лекарственные формы препарата стимулируют регенерацию поврежденных тканей, однако в зависимости от типа раны и применяемой лекарственной формы различается скорость регенерации. В случае резаных ран ткань регенерирует быстрее при инъекционном введении разведенной лиофилизованной формы препарата плазмиды. В случае операционных ран регенерация идет быстрее при использовании гелевой формы препарата.

Таким образом, обе изготовленные лекарственные формы препарата (лиофилизат, гель) обеспечивают регенерацию тканей и показаны к использованию при лечении (для заживления) ран различной этиологии.

Ключевые слова:
Генная терапия, Инсулиноподобный фактор роста, Плазмида, Регенерация

Аннотация:
A simple and efficient method for expression in Escherichia coli cells and purification of a recombinant matrix protein, p17, of human immunodeficiency type I virus has been described. HIV-1 subtype A DNA sequence encoding p17 was obtained by amplification of the viral gag gene segment and cloned into an expression vector under the control of T7Lac promoter. The conditions for cell growth and induction of p17 synthesis by lactose and its further purification by metal chelate chromatography were optimized. p17 preparations with 97% purity were obtained; the yield of the protein of 28 mg per 1l of culture was achieved. The obtained protein was capable of binding antibodies from blood serum of a HIV-infected patient during immunoblotting.

Ключевые слова:
p17 protein, Human immunodeficiency virus, HIV1, Subtype A, Gag

Аннотация:
The rate and character of superficial tissue regeneration after wounds, burns, and other traumas depend on cell proliferation within the damaged area. The acceleration of wound healing via the stimulation of cell proliferation and extracellular matrix synthesis is one of the most important tasks of modern medicine. There are gene therapy approaches to wound treatment, such as the transfer of genes that encode mitogenic growth factors to the wound area. The most important step in the development of the gene therapy approaches is the design of gene delivery tools. Despite the high efficiency of viral vectors, the nonviral approaches have some advantages (low toxicity, low immunogenity, safety, and the absence of side effects). Among the nonviral gene delivery tools molecular conjugates are the most popular due to their efficiency, simplicity, and the capacity for targeted gene transfer. In the present work, we have developed two molecular conjugates, NLS-TSF7 and NLS-TSF12, which consist of the modified signal of the nuclear localization of the T-antigen of the SV40 virus (cationic part) and the peptide ligands of the mammalian transferrin receptor (ligand part). Those conjugates bind to plasmid DNA via the formation of polyelectrolytic complexes and are able to deliver plasmid DNA into cells that express transferrin receptors through receptor-mediated endocytosis.

The transfer of the expression vector of the luciferase gene in the complex with the molecular conjugate NLS-TSF7 to murine surface tissues led to about the 100-fold increase of luciferase activity in comparison with the transfer of the free expression vector. The treatment of mice with incised wounds with complexes of the expression vector of the synthetic human gene that encodes insulin-like growth factor 1 with molecular conjugate NLS-TSF7 led to the acceleration of wound healing in comparison with mice treated with the free expression vector. The obtained results confirm the high efficiency of the developed approach to regenerative gene therapy for treating the superficial tissue damage of mammals.

Ключевые слова:
Molecular conjugates, Gene transfer, Regenerative gene therapy, Transferrin receptor, Insulin-like
growth factor 1.

Аннотация:
Скорость и характер регенерации кожных покровов после ранений, ожогов и других травм зависят в основном от пролиферации клеток в зоне поражения. Ускорение заживления ран путем стимуляции проr лиферации клеток и синтеза межклеточного вещества является одной из важнейших задач современной практической медицины. Для лечения ран, как и для лечения многих других заболеваний, используют генотерапевтические подходы. Для этих целей, как правило, применяют генетические конструкции на основе векторов экспрессии митогенных факторов роста. Ключевым моментом, определяющим эффекr тивность генотерапии, является выбор способа переноса ДНК в ткани животного. Невирусные средства переноса лишены многих побочных эффектов и могут применяться для этих целей. Молекулярные конъr югаты на основе поликатионных пептидов эффективны и просты в использовании, а также способны обеспечить направленный перенос за счет введения в состав пептида лиганда к клеточным рецепторам.

В данном исследовании мы разработали два молекулярных конъюгата на основе модифицированного сигнала ядерной локализации Тrантигена вируса SV40 (катионная составляющая) и пептидных лигандов к рецептору трансферрина (лигандная составляющая). Эти конъюгаты эффективно связываются с плазr мидной ДНК и обеспечивают ее перенос в клетки, экспрессирующие рецепторы трансферрина, с поr мощью рецепторопосредованного эндоцитоза. Применение пептидов при доставке плазмидной ДНК с репортерным геном люциферазы в раны животных увеличило эффективность переноса в 100 раз. Обраr ботка ран животных комплексами вектора экспрессии синтетического гена инсулиноподобного фактора роста человека с молекулярным конъюгатом ускоряло регенерацию не менее чем в 1.5 раза по сравнеr нию с заживлением ран животных, обработанных свободным вектором экспрессии. Полученные резульr таты свидетельствуют о высокой эффективности разработанной системы невирусной регенерационной генотерапии поверхностных повреждений млекопитающих.

Ключевые слова:
Молекулярные конъюгаты, Перенос генов, Регенеративная генотерапия кожных покровов, Трансферриновый рецептор, Инсулиноподобный фактор роста 1

Аннотация:
Сконструированы экспрессионные плазмиды pBMCgagA(Hum) и pBMCdef-2β, осуществляющие экспрессию в клетках млекопитающих белка Gag вируса иммунодефицита человека 1-го типа субтипа А и дефенсина 2β мыши соответственно. При внутримышечном введении мышам BALB/C плазмиды рВМСgagA(Hum) в дозе 100 мкг/мышь в крови мышей появлялся белок Gag в концентрациях до 9,16 пг/мл и антитела к белку Gag в титрах 1:10. При совместном внутримышечном введении мышам линии ВАLB/c двух плазмидных ДНК pBMCdef-2β и рВМСgagA(Hum) происходило усиление образования антител к белку Gag (титры антител > 1:1000). Возможно, иммуностимулирующее действие дефенсина-2β связано с его способностью к хемоаттрактации незрелых дендритных клеток к месту инъекции, которые, в свою очередь, эффективно поглощают, процессируют и презентируют в виде пептидов вирусный белок Gag Т4-лимфоцитам.

Ключевые слова:
ВИЧ-1, Антитела, ДНК-иммуноген, ДНК-иммунизация, Дефенссин-2β, Генетический адъювант, Иммуномодулятор, Дендритные клетки

Аннотация:
Сконструированы экспрессионные плазмиды pBMCgagA(Hum) и pBMCdef-2β, осуществляющие экспрессию в клетках млекопитающих белка Gag вируса иммунодефицита человека 1-го типа субтипа А и дефенсина 2β мыши соответственно. При внутримышечном введении мышам BALB/C плазмиды рВМСgagA(Hum) в дозе 100 мкг/мышь в крови мышей появлялся белок Gag в концентрациях до 9,16 пг/мл и антитела к белку Gag в титрах 1:10. При совместном внутримышечном введении мышам линии ВАLB/c двух плазмидных ДНК pBMCdef-2β и рВМСgagA(Hum) происходило усиление образования антител к белку Gag (титры антител > 1:1000). Возможно, иммуностимулирующее действие дефенсина-2β связано с его способностью к хемоаттрактации незрелых дендритных клеток к месту инъекции, которые, в свою очередь, эффективно поглощают, процессируют и презентируют в виде пептидов вирусный белок Gag Т4-лимфоцитам.

Ключевые слова:
ВИЧ-1, Антитела, ДНК-иммуноген, ДНК-иммунизация, Дефенссин-2β, Генетический адъювант, Иммуномодулятор, Дендритные клетки

Аннотация:
Разработан простой и эффективный метод экспрессии в клетках Escherichia coli и очистки рекомбинантного матриксного белка р17 вируса иммунодефицита человека I типа. Последовательность, кодирующую белок р17 ВИЧ-I субтипа А, получали путем амплификации участка вирусного гена gag и клонировали в экспрессионном векторе под контролем промотора T7Lac. Подобраны условия культивирования клеток, индукции синтеза белка р17 лактозой и последующей его очистки с помощью металлохелатной хроматографии. Получены препараты белка р17 с чистотой 97%. Выход очищенного белка составил 28 мг из 1 л культуры. Полученный белок р17 связывается при иммуноблотинге с сывороткой крови ВИЧ-инфицированного пациента.

Ключевые слова:
Белок Р17, Вирус Иммунодефицита Человека, ВИЧ-1, Субтип А

Аннотация:

Background
Earlier we suggested the concept of the positive evolutionary role of tumors. According to this concept, tumors provide conditions for the expression of evolutionarily new and/or sleeping genes in their cells. Thus, tumors are considered as evolutionary proving ground or reservoir of expression. To support this concept we have previously characterized in silico and experimentally a new class of human tumor-related transcribed sequences.

Results
In this article we describe results of further studies of previously described tumor-related sequences. The results of molecular phylogeny studies, Southern hybridization experiments and computational comparison with genomes of other species are presented.

Conclusion
These results suggest that these previously described tumor-related human transcripts are also relatively evolutionarily new.